腫瘤免疫治療，實(shí)際上分為兩大類(lèi)：

一種把腫瘤的特征“告訴”免疫細胞，讓它們去定位，并造成殺傷，例如CAR-T、TCR-T、TIL、MASCT（DC-CTL）等；

另一種是解除腫瘤對免疫的耐受/屏蔽作用，讓免疫細胞重新認識腫瘤細胞，對腫瘤產(chǎn)生攻擊，例如PD-1抗體、PD-L1抗體、CTLA-4抗體等。臨床上將不同的免疫療法聯(lián)合應用效果有可能會(huì )更好。

目前有三種使用效應T細胞的過(guò)繼細胞療法(Adoptive cellular therap,ACT)正朝著(zhù)注冊審批的方向行進(jìn)（圖1）。

圖1：目前細胞治療的幾種途徑

腫瘤浸潤性淋巴細胞（TILs）雖發(fā)展緩慢，但數十年來(lái)一直進(jìn)步，近期一項針對轉移性黑色素瘤的國際III期隨機試驗已經(jīng)完成（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00200577），這項研究前后經(jīng)歷十多年，最終結果還是不錯的，不管在復發(fā)還是長(cháng)期生存方面，TILs都是有效的。

那么，什么是CAR-T和TCR-T呢？

CAR-T（Chimeric Antibody Receptor Engineered T Cell）和基因修改的T細胞受體（Gene Modified TCR）。這兩種技術(shù)的一個(gè)共同點(diǎn)在于通過(guò)基因改造的手段提高T細胞受體對特異性癌癥細胞抗原的識別能力和進(jìn)攻能力。因此也都統稱(chēng)為“T細胞受體重新定向”技術(shù)（Tcell receptor redirection）。但兩者所使用的方法是不同的。

嵌合抗原受體T細胞技術(shù)（CAR-T）以及T細胞受體（TCR）嵌合型T細胞（TCR-T）作為當前過(guò)繼性細胞回輸治療ACT技術(shù)兩大最新的免疫細胞技術(shù)，因其能夠表達特異性受體靶向識別特異性的細胞如腫瘤細胞，受到廣泛的關(guān)注和研究，從最開(kāi)始的基礎免疫研究轉變?yōu)榕R床應用?；诤铣缮飳W(xué)，免疫學(xué)，遺傳改造技術(shù)，使得合成改造的特異性功能加強版的T細胞成為可能。CD19抗原特異性CAR-T 細胞用于治療B細胞白血病和淋巴瘤臨床試驗中，顯示出持續的疾病緩解效果。由于CAR-T/TCR-T技術(shù)的優(yōu)越表現，以及廣闊的應用前景，從而使其進(jìn)入了當前激烈的制藥行業(yè)競技舞臺中與傳統的制藥業(yè)一較高低。

通過(guò)修飾，使正常供體細胞的同種異體排異反應失活，同時(shí)使用抗腫瘤的CAR或TCR武裝它；或利用抗腫瘤分子武裝患者自體細胞。在實(shí)體腫瘤中，活檢標本可用來(lái)分離TILs并進(jìn)行擴增。大多數情況下，病人在接受抗腫瘤淋巴細胞輸注前需要接受必要的預處理，并須謹慎處置治療引發(fā)的毒性。

T細胞和T細胞受體

T細胞是我們肌體細胞免疫機制中非常重要的一類(lèi)細胞。這類(lèi)細胞之所以被稱(chēng)為T(mén)細胞是因為它們成熟和分化的過(guò)程是在胸腺（Thymus）里完成的。

T細胞有一點(diǎn)像我們身體的“紀委巡視組”。它們在肌體內巡邏時(shí)，不斷地和各種細胞進(jìn)行“親密”接觸，以檢查細胞內部是否正常。而這種接觸和檢查工作主要是通過(guò)一種稱(chēng)之為“T細胞受體”來(lái)進(jìn)行的。細胞方面和“T細胞受體”交接的是一類(lèi)被稱(chēng)為“MHC”（或者在人類(lèi)被稱(chēng)為HLA）的表面蛋白。這類(lèi)蛋白的功能就是把細胞內部蛋白分解后的片段呈現給T細胞。供T細胞檢查。如果T-細胞發(fā)現其中有變異的蛋白片段，就可能對細胞發(fā)起進(jìn)攻，摧毀變異的細胞。這也就是我們免疫系統如何能夠長(cháng)期保持我們無(wú)癌生活的主要原因。

但癌癥還是會(huì )經(jīng)常發(fā)生。這里的原因固然很多，也很復雜。但總體來(lái)講，癌癥發(fā)生說(shuō)明我們的T細胞已經(jīng)失去了識別癌細胞以及摧毀癌細胞的能力。而提高T細胞識別能力的關(guān)鍵就在于改進(jìn)“T細胞受體”。從這個(gè)角度去思考，就產(chǎn)生了我們剛剛提到的這兩種細胞免疫治療技術(shù)：CAR-T和基因修改的T細胞受體。

CAR-T與TCR-T的區別

我們可以打一個(gè)簡(jiǎn)單的比喻。CAR-T是一種“換頭”技術(shù)。它把TCR的“頭”直接換成一個(gè)特異性的抗體。這樣就可以讓T細胞就在抗體的指引下直接攻擊癌細胞。和CAR-T這種大手筆的改動(dòng)相比，基因修改的T細胞受體可以說(shuō)只是簡(jiǎn)單地“理了理發(fā)”。

用來(lái)“理發(fā)”的T-細胞并非任何T細胞。這類(lèi)T細胞通常會(huì )“侵入”癌組織。這說(shuō)明他們對癌細胞有一定的識別能力。事實(shí)上，我們可以在這類(lèi)T細胞中發(fā)現對癌細胞相關(guān)抗原（Tumor Associated Antigen, TAA）具有特異性識別能力的T細胞。這類(lèi)抗原包括CEA，Her-2，CD19，gp100, MART-1, MAGA-A3, NY-ESO-1, 等等。這些TAA在不同的癌癥中都有相對特殊性的表達。因而也成為免疫系統的攻擊對象。盡管如此，這些天然（或者通過(guò)其他手段制造的）的“抗癌”T細胞的識別能力常常比較弱，因此不能形成對癌細胞的有利攻擊。在這種情況下，可以通過(guò)部分基因修改的方法來(lái)提高這些TCR對相應TAA的“親和力”和戰斗力?！盎蛐薷牡腡CR”技術(shù)也因此被稱(chēng)為“親和力增強的TCR”技術(shù)（Affinity-Enhanced TCR）。

這次《自然-醫學(xué)》雜志報道的就是由美國馬里蘭大學(xué)醫學(xué)院，濱州大學(xué)醫學(xué)院和目前免疫治療的“當紅炸子雞”之一：Adaptimmune公司聯(lián)合研發(fā)的一款“基因修改的TCR”。在修改了幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸以后，這些基因修改的TCR大大提高了和一種常見(jiàn)的癌癥TAA，NY-ESO-1，的親和力。從而可以用來(lái)進(jìn)攻有NY-ESO-1過(guò)量表達的癌癥，比如多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma）。 在這次臨床試驗中，80%的多發(fā)性骨髓瘤患者有了很好的臨床應答。其中70%的患者達到完全或接近完全應答。平均無(wú)進(jìn)展生存期達到了19個(gè)月。這樣的結果可以說(shuō)是非常驚人振奮的。

目前這兩種方法，發(fā)展都比較迅速，但是都不完美。

開(kāi)發(fā)最佳的CAR設計

過(guò)去的20年中CAR的設計已經(jīng)取得了長(cháng)足的進(jìn)展（圖2）。1991年有3個(gè)實(shí)驗室報道了第一代CAR的設計。Kuwana等人最先構造了嵌合受體，使T細胞不依賴(lài)于MHC-I類(lèi)分子識別靶細胞。Roberts、Finney和 Lawson 率先構造了含有CD28或4-1BB共刺激分子的二代CAR。在臨床前模型中，使用基于CD28的體外擴增體系，在異種移植瘤模型中 4-1BB比CD28對CAR的功效更有益。兩種CAR模型都顯示出臨床前和臨床療效。Long等人的最近研究表明，基于CD28構造的CAR加強并加速T細胞衰竭，而基于4-1BB構造的CAR減緩了T細胞衰竭。我們的研究結果與其結論一致，并且發(fā)現CD28內切域能傳遞使效應T細胞終末分化的信號。從這些研究中得出的周密的結論并不是說(shuō)某個(gè)人源內切域必然比另一個(gè)好，而是說(shuō)CD28信號是生產(chǎn)有效的臨床T細胞制品的關(guān)鍵，而4-1BB提升了CAR-T細胞的持久性。

圖2：CAR-T細胞的設計

第一代CAR引入了CD3ζ鏈或類(lèi)似的信號域?；诳贵w再定向的T細胞首先由Kuwana設計并由Eshhar完善。Roberts和Finney首先設計了整合CD28或CD137信號域的第二代CARs

為了進(jìn)一步改良CAR的設計，許多研究組開(kāi)始著(zhù)眼于發(fā)展第三代CAR，不僅包括“信號1”、“信號2”，還包括了額外的共刺激信號。不同研究者們用不同材料開(kāi)展的研究所得到的第二代CAR和第三代CAR的比較結果是矛盾的。不過(guò)，新一代CAR-T能有效控制毒性。

透視ACT毒性

十多年來(lái)，許多ACT臨床試驗表明各類(lèi)工程化的細胞產(chǎn)品相當安全，但有效性相對缺乏。過(guò)去的4年里，ACT的療效發(fā)生了一場(chǎng)革命性變化，體現在工程化的T細胞可以在體內大量擴增，甚至在某些情況下可以持續性存活。這徹底的改變了ACT的療效，尤其體現在CAR-T細胞應用于癌癥治療，但是在顯示出療效的同時(shí)，伴隨有毒性。

細胞因子釋放綜合征（CRS）

CAR-T治療骨髓源腫瘤最顯著(zhù)的毒性是CRS。高度增殖的T細胞能引起CRS，表現為高熱和肌痛，不穩定的低血壓和呼吸衰竭。這是一個(gè)意想不到的結果，因為在臨床前動(dòng)物模型中沒(méi)有出現類(lèi)似癥狀。

從CRS觀(guān)察中發(fā)現一個(gè)關(guān)鍵的點(diǎn)，除了預期的效應細胞因子INF-γ外，IL-6在CAR-T治療的細胞指數級增殖期間也會(huì )迅速提升。CRS可能直接與另一個(gè)毒性相關(guān)聯(lián)，即巨噬細胞活化綜合征。

幸運的是，針對這些嚴重的CRS，尋找到了一種治療方法，應用IL-6受體拮抗劑tocilizumab來(lái)阻斷IL-6的作用。采用高度增殖的CAR-T治療ALL患者，確認了IL-6的出現和tocilizumab對嚴重CRS的療效，并且我們觀(guān)察到了雙特異性T細胞銜接抗體blinatumomab引起的嚴重CRS具有類(lèi)似機制。

另一個(gè)重要發(fā)現是，嚴重的CRS幾乎發(fā)生在高疾病負荷病人身上。這意味著(zhù)將CAR應用于疾病早期患者身上，在疾病惡化之前使用CAR-T來(lái)殺滅腫瘤，發(fā)生嚴重CRS風(fēng)險將大大降低。

關(guān)于靶向毒性

T細胞增殖可直接導致CRS。它不依賴(lài)于改造的T細胞的抗原特異性，即使CAR是相同的，治療不同的疾病有可能CRS風(fēng)險和癥狀也會(huì )有所不同。例如在治療CLL和彌漫大B時(shí)CRS較輕而治療ALL時(shí)CRS相對較重。

除了CRS，還存在由工程改造的T細胞的抗原特異性導致的“靶向”毒性。例如溶瘤綜合征，它直接是由腫瘤細胞的裂解而導致的。當CARs靶向于B細胞表面表達的靶點(diǎn)如CD19時(shí)，會(huì )引起B細胞發(fā)育不良，這就是一個(gè)“靶向”毒性，但卻錯誤的攻擊了正常組織細胞的結果。只要CD19 CAR-T細胞長(cháng)時(shí)間存在，B細胞發(fā)育不良的情況就不會(huì )改善，因此，B細胞缺乏可作為CAR-T療效持續的標志。B細胞發(fā)育不良與CD20特異性單抗治療一樣會(huì )造成嚴重的低丙種球蛋白血癥，需要靜脈注射免疫球蛋白。不像CD20 單抗 rituximab引起的相對較輕的低丙種球蛋白血癥，CAR引起的長(cháng)期B細胞發(fā)育不良，靜脈注射免疫球蛋白非常必要。

最近報告了輸注改造的T細胞引發(fā)致命毒性的2個(gè)案例，有一例患者接受了HER2-CAR治療，兩例患者接受了靶向MAGE-A3的TCR-T細胞治療。在這2個(gè)案例中，均是因為正常組織表達這些靶點(diǎn)，導致急性不可逆的心肺毒性。所有的靶向毒性均是由于改造的T細胞無(wú)法區別表達靶向抗原的正常細胞和腫瘤細胞所致。高親和力TCR改造的T細胞引起的毒性可能與親和力成熟過(guò)程有關(guān)，因為“非腫瘤靶向”的高親和力TCR的產(chǎn)生在生理條件下將受到限制。在設計TCR的過(guò)程中，小心篩選高親和力的TCRs，并研究其對靶蛋白之外的其他抗原表位的識別顯得十分必要。根據已有報道，輸注HLA-A2/MAGE-A3特異性的TCR-T細胞能夠產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

神經(jīng)毒性

CAR-T治療白血病會(huì )引起神經(jīng)系統癥狀，這是一個(gè)預期之外且目前尚不清楚的現象。幾個(gè)研究小組報道，這些癥狀具有多樣性但可自行消退，如譫妄、語(yǔ)言障礙、運動(dòng)障礙、緘默癥和癲癇發(fā)作。雖然與全身CRS的發(fā)生有些時(shí)間上的關(guān)聯(lián)，當然也與CAR-T存在于腦脊液中相關(guān)，但是使用tocilizumab這些癥狀不會(huì )有改變。這些癥狀的機制與靶組織仍有待確認。

其他毒性

輸注活化的T細胞存在引起自身免疫性疾病的風(fēng)險。靶向黑色素瘤的ACT治療可誘發(fā)白癜風(fēng)。輸注活化的T細胞產(chǎn)生如皮疹、結腸炎、垂體炎等毒性的報道較少。CAR修飾的T細胞尚未出現這些問(wèn)題。輸注同種異體T細胞存在抗宿主移植病的潛在風(fēng)險。這可能會(huì )引起曾接受同種異體造血干細胞移植的患者的擔心。幸運的是，從受體采集已耐受供體來(lái)源的T細胞（而不是捐獻者），抗移植物宿主病的風(fēng)險會(huì )非常低。當然有一種方法是利用自殺系統來(lái)限制毒性，如經(jīng)典的caspase-9 誘導表達系統，或包含特定表面靶點(diǎn)如CD20。在含有caspase-9誘導系統下，一種水溶性活化劑可激活Caspase系統導致T細胞凋亡。包含CD20基因修飾的CAR-T細胞，可用單抗如rituximab來(lái)清除“違規”的細胞。

該領(lǐng)域面臨的問(wèn)題

近期實(shí)驗室研究正在解決在科學(xué)與工程方面遇到許多挑戰。下面我們談一談當前面臨的挑戰。

細胞制品的構成:

早期的細胞治療主要是輸注高分化的CD8+T細胞。這些CTL細胞具有很強的細胞毒性，但是輸注后沒(méi)有足夠的復制能力，除了個(gè)別情況外，注入患者體內的T細胞持久性較差。目前普遍同時(shí)輸注CD4+與CD8+T細胞，很可能是因為CD4+T細胞提供生長(cháng)因子和其他信號以維持輸注的CTL的功能和活性。

另外，在小鼠中的研究有時(shí)候會(huì )誤導處理人源T細胞的方法。例如，由于受到端粒退化的影響，人源T細胞的復制能力有限，在小鼠模型中卻沒(méi)有這個(gè)特點(diǎn)，而人CD4+細胞比小鼠CD4+細胞具有更強的細胞毒性?，F在的問(wèn)題是是否需要利用流式細胞術(shù)或其他的方法分離細胞亞群并進(jìn)行獨立培養。CD4+和CD8+T細胞最佳細胞培養條件不同，這因為CD4 +和CD8 + T細胞信號轉導途徑不一樣。此外，細胞分離法可去除對效應T細胞療法存在潛在危害的Treg細胞。況且，需要從輸注的T細胞中去除腫瘤細胞，對白血病患者而言，這尤其具有挑戰性。然而，在GMP生產(chǎn)中有些技術(shù)使細胞制備成本大大增加，如通過(guò)流式細胞術(shù)或磁珠分選細胞可使成本迅速增加10000美元甚至更多。

年齡問(wèn)題:

與上述問(wèn)題相關(guān)，輸注處于什么分化階段的T細胞最佳？對小鼠和人類(lèi)的研究結果表明，naive或中心記憶細胞是最好的。對只有少量naive T細胞的老年人而言，如何獲取這類(lèi)細胞是個(gè)挑戰，且化療或其他疾病通常會(huì )進(jìn)一步放大難度。

從采用CD19 特異性CAR-T治療白血病患者的數據中表明，擴增能力是預測成功的最重要的生物學(xué)標志。一種方法是在全血淋巴細胞中分離中心記憶或naive T細胞。與此相反，一個(gè)更簡(jiǎn)便粗放的方法是使用大量T細胞在特定培養條件下維持naive或中心型記憶細胞的擴增。

后一種方法基于特異性共刺激信號可以促使細胞定向分化的原理。如CD28的刺激可使CD4細胞保持中心記憶細胞狀態(tài)，4-1BB可以促使CD8中心記憶細胞的增殖。相反ICOS共刺激分子可以促使和穩定Th17細胞的生長(cháng)。利用T細胞的干細胞樣特性是非常有希望的，Wnt信號通路的激活可以促進(jìn)記憶干細胞的增殖。

是否存在統一的最佳細胞制品配方？抑或針對不同的腫瘤需要不同的配方？

CD19 CAR-T治療B細胞惡性腫瘤顯示出的驚人且意想不到的療效能否出現在治療實(shí)體瘤患者身上還未可知。我們發(fā)現CAR-T在體外殺滅低分化腺癌細胞的效率類(lèi)似于白血病。然而，仍然有待進(jìn)一步確定是否需要修改細胞組成類(lèi)型或細胞培養條件，用來(lái)優(yōu)化實(shí)體瘤患者體內改造的T細胞的轉運和持久性。

與惡性血液疾病的散在分布不同，采用細胞工程的方法優(yōu)化T細胞向實(shí)體瘤塊轉運，如成膠質(zhì)細胞瘤和胰腺癌，可能會(huì )有所不同。已提出一種方法是利用靶向策略，如采用基因工程的手段，使用各種趨化因子或趨化因子受體促使T細胞向腫瘤部位富集。其他方法包括對腫瘤或患者進(jìn)行預處理，如進(jìn)行放療，注射溶瘤載體以及在瘤內直接注射T細胞。

最優(yōu)的共激活結構域在CD4+和CD8+ T細胞內是一樣的嗎？

以往研究表明不同亞群的T細胞培養條件是不同的。這就提出一個(gè)問(wèn)題，不同淋巴細胞亞群的T細胞是否需要不同的信號分子進(jìn)行武裝呢？為著(zhù)手解決這個(gè)問(wèn)題對CD4+和CD8+T細胞胞內區CD28, 4-1BB和ICOS進(jìn)行了評估。在異種移植腺癌的人源化小鼠中，我們發(fā)現采用ICOS信號域的CD4+ CAR-T細胞更為優(yōu)越，而CD8+T細胞常優(yōu)選4-1BB。如此增加細胞制備的復雜度是否能使臨床實(shí)驗受益尚有待進(jìn)一步確定。此外，最佳的T細胞亞群比例和信號分子的構造在不同的腫瘤微環(huán)境中很可能會(huì )有差異。比如在一些臨床前腫瘤模型中改造的Th17細胞比Th1細胞更優(yōu)越。

生存與毀滅：自殺結構能否減弱非腫瘤靶向引起的毒性?

使用改造的T細胞最大的不確定性是利用生物合成技術(shù)誘導的新的、增強的細胞效應是否會(huì )引發(fā)意外的脫靶毒性。

CAR-T細胞的非腫瘤靶向毒性和TCR細胞的脫靶毒性被格外關(guān)注。有多種方法可以緩解這些問(wèn)題。我們發(fā)現利用編碼CAR的mRNA轉染T細胞，限制CAR僅在轉染T細胞中表達，對評估出現的直接毒性有幫助。當出現毒性反應，停止細胞輸注，毒性會(huì )迅速減弱。研究人員也提出了許多誘導基因修飾T細胞凋亡的方法。這些方法很可能都會(huì )被整合，以便按需清除T細胞，滿(mǎn)足嚴格的安全需求。

結 論

基于正在進(jìn)行的試驗，表達CARS和TCRS的T細胞已經(jīng)為廣泛的商業(yè)應用準備就緒。華爾街的資源正推動(dòng)這個(gè)曾因投資不足而被限制的領(lǐng)域的進(jìn)步。在輸注的T細胞中引入或刪除基因，提供了能克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境的新細胞制品，并且最后可能不需要使用免疫檢查點(diǎn)封閉抗體。ACT先進(jìn)的基因工程技術(shù)的到來(lái)，將會(huì )使利用合成生物學(xué)原理進(jìn)行癌癥、慢性感染和自身免疫性疾病的治療取得顯著(zhù)進(jìn)展。