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CAR-T 免疫療法 (Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy)

2010年五月，家住美國賓州Hershey市的剛滿(mǎn)五歲的女孩Emily Whitehead被確診患急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia, ALL）。當時(shí)她像很多同病患兒一樣，在住處附近的Hershey Medical Center開(kāi)始化療?；熞荒臧牒髲桶l(fā)。在以后的3個(gè)多月，Emily繼續接受強化性化療，為2012年二月份的骨髓移植做準備。ALL是一種常見(jiàn)的兒童癌癥。雖然百分之八十五的ALL兒童在經(jīng)過(guò)兩年的標準化療后有很好療效，但是對于化療耐藥的兒童就沒(méi)有其它有效治療方法。Emily的復發(fā)證明她患的是那種抗藥的ALL。
骨髓移植前兩周，Emily再次復發(fā)。盡管醫生用盡了各種化療，都不能阻止病情惡化。2012年4月，Emily從當地醫院轉到了費城兒童醫院(CHOP)。那里的醫生告訴家長(cháng)，因為兩次化療失敗，可試用一種正在進(jìn)行I期臨床試驗的新療法。同時(shí)醫生也告訴家長(cháng)該療法的高風(fēng)險。Emily 的的父母，Tom 和Kari，考慮女兒病情繼續惡化，表達了他們同意試一試新療法的想法。這樣，在費城兒童醫院癌癥中心，Emily正好符合實(shí)驗性CAR-T細胞治療，新的臨床試驗開(kāi)始。
圖1，CAR-T治療前后的Emily

2012年4月17日，Emily成為第一個(gè)接受CAR-T細胞治療的兒科患者。接受治療三周后，她奇跡般恢復。CAR-T細胞治療對Emily 完全有效。三個(gè)月和六個(gè)月后再次檢查她的骨髓，骨髓里已查不到任何癌癥細胞， 而且抗癌癥CAR-T細胞仍然存活在她的體內。
對于Kari和Tom，不可思議的是，Emily在短短幾個(gè)月內變化很大。經(jīng)過(guò)治療，她已能回到家，上學(xué)，踢足球和溜狗。她像任何其他小女孩一樣, 可以正常生活。
圖2，治療后的Emily， 1 年，2 年，3 年，4 年，以及和前總統的照片。

CAR-T 細胞治療為什么能創(chuàng )造奇跡，是由于科學(xué)家將T 淋巴細胞改裝成能夠識別和殺傷腫
瘤的T 淋巴細胞。 腫瘤免疫主要由細胞毒性T 細胞（CTL）介導?；罨腡 淋巴細胞才能殺傷腫
瘤。當腫瘤細胞抗原遞呈特異性信號，會(huì )被T 細胞表面受體(TCR)識別。TCR 可變區和抗原的相
互作用會(huì )引發(fā)與TCR 相連的CD3 的ζ亞基激活產(chǎn)生第一信號, T 淋巴細胞會(huì )有應答反應。僅有第
一信號引起T 淋巴細胞反應是不足以殺傷腫瘤的，需要有協(xié)同刺激信號如CD28 參與和激活所產(chǎn)
生的第二信號才能夠引起有效的T 細胞反應。 兩個(gè)信號都被激活是活化T 淋巴細胞，并且產(chǎn)生反
應的重要條件。
綜上所述，T 細胞殺傷腫瘤是經(jīng)過(guò)其TCR 識別腫瘤抗原，引發(fā)與TCR 相連的CD3 的ζ亞
基激活，同時(shí)在激活的協(xié)同刺激第二信號CD28 參與下，殺傷或/和消滅腫瘤細胞。腫瘤的形成是
由于種種原因，T 細胞不能識別腫瘤抗原，清除細胞，導至細胞無(wú)控制生長(cháng)。除了CD28 外，還
有其它分子，如4-1BB, OX40 也充當正向協(xié)同刺激信號。
人為的針對腫瘤的靶點(diǎn)制備特異性抗體，然后利用基因工程技術(shù)將抗體具有結合功能的區
域替代T 細胞受體(TCR)的可變區，形式TCR 和抗體嵌合體（Chimeric Antigen Receptor,
CAR），利用病毒載體，加入到人體外的T 細胞，抗體能表達在T 細胞表面，這種含有嵌合抗體
的T 細胞叫CAR-T 細胞(CAR 加上 T 細胞)。當CAR-T 細胞輸回到病人體內，抗體就能識別并特
異性結合腫瘤細胞上的靶點(diǎn)，激活T 細胞并使之殺死腫瘤細胞，達到治療的目的。（圖3）
圖3， T 細胞兩個(gè)激活信號，CAR將兩個(gè)激活信號結合在一起。

典型CAR的結構由胞外抗原結合區、跨膜區域和胞內信號轉導區組成。其中胞外抗原結合區來(lái)源于單克隆抗體的單鏈抗體 (single chain fragment variable. scFv)，單鏈抗體是由輕鏈 (VH) 和重鏈 (VL)通過(guò)連接而形成的。scFv是CAR結構里的第一個(gè)關(guān)鍵部位，它能識別腫瘤特異性抗原，即所說(shuō)的靶點(diǎn)，比如CD19, EGFR等，而不是需要加工遞呈出來(lái)的抗原多肽。因此這樣的結構解決了兩大問(wèn)題：靶向性問(wèn)題和繞開(kāi)抗原遞呈的問(wèn)題。（圖4，5）
圖4，CAR-T細胞。

圖5，TCR的部份被scFv替換，T細胞改造成CAR-T細胞。

細胞內信號轉導區主要為CD3ζ或FcεRIγ含有免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAM,)以及第二刺激信號CD28或者其它分子，4-1BB, OX40等正向協(xié)同刺激信號。根據CAR結構的進(jìn)化，有第一代，第二代和第三代。幾代CAR-T的區別在于細胞內信號轉到區連入了不同的正向協(xié)同刺激信號：第一代CAR(左)由單鏈抗體通過(guò)跨膜區域與胞內信號傳導區(ITAM)相連, ITAM通常為CD3ζ或FcεRIγ; 第二代CAR(中)的胞內信號轉導區引入了共刺激分子, 主要為CD28 或4-BB; 第三代CAR(右)同時(shí)引入了兩個(gè)共刺激分子, 主要為CD28加上4-BB 或OX40。早期的實(shí)驗證明了CAR-T 的可行性，然而第一代CAR 只能引起短暫的T 細胞增殖和較低的細胞因子分泌，不能提供長(cháng)時(shí)間的T 細胞擴增信號和持續的體內抗腫瘤效應。依照T 細胞活化的雙信號學(xué)說(shuō)，T 細胞的激活和增殖需要兩個(gè)共刺激信號；第二代、第三代CAR 引入了共刺激分子信號序列，旨在提高T 細胞的細胞毒活性、增殖性與存活時(shí)間，并且促進(jìn)細胞因子的釋放。
圖6，

CAR-T治療，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)有五步：
1： 從癌癥病人身上分離免疫T細胞。
2: 利用基因工程技術(shù)給體外的T細胞加入一個(gè)能識別腫瘤細胞，
并且同時(shí)激活T細胞殺死腫瘤細胞的嵌合抗體，從而使T細胞
變身為CAR-T細胞。
3： 體外培養，大量擴增CAR-T細胞。
4： 把擴增好的CAR-T細胞輸回病人體內。
5： 嚴密監護病人，控制身體的劇烈副反應（見(jiàn)后述）。
圖7，CAR-T治療的流程：

針對CD19、CD20和CD22為靶抗原的CAR-T細胞治療B細胞惡性腫瘤研究較多, 原因就是即便損傷了成熟B細胞, 也只是暫時(shí)的、可恢復的。美國賓州Hershey女孩 ，Emily Whitehead 患有急性淋巴細胞白血病(ALL)，治療靶點(diǎn)為CD19。
圖8，

從圖8中看出，CD19在pre-B 和 成熟B細胞，包括正常和惡性增殖的B細胞表達, 但是淋巴干細胞和成熟漿細胞沒(méi)有CD19。帶有抗CD19 scFv 的CAR-T 細胞可以攻擊pre-B 和成熟B細胞而不傷害淋巴干細胞，保留了淋巴干細胞的再生功能。使用抗CD19的CAR-T細胞進(jìn)行
治療，其毒性?xún)H限於B細胞系，B 細胞功能缺陷可通過(guò)輸入丙種球蛋白來(lái)彌補。CAR-T 細胞可以在病人體內持續很長(cháng)一段時(shí)間，5年后今天的Emily Whitehead 體內仍有CAR-T細胞。
CD19靶點(diǎn)的CAR-T臨床治療進(jìn)展最為突出，在治療白血病ALL、CLL (Chronic Lymphocytic Leukemia),和NHL(B 細胞non-Hodgkin lymphomas)的領(lǐng)域捷報頻傳。從2012年到2016年，美國賓州大學(xué)教授Carl H. June 用CD19 CAR-T治療了60個(gè)ALL病人，其療效高達93%。這些ALL患者往往是復發(fā)或抗藥的，其它治療方法都已耗盡。截止到2016年5月，Carl H. June 用CD19 CAR-T已經(jīng)治療了368 個(gè)B淋巴細胞腫瘤病人。
其它研究較多的靶點(diǎn)有Her2、GD2、CEA、mesothelin、BCMA等。需要做更多研究的是；尋找腫瘤特異性更強的抗原，或相同抗原高表達在腫瘤細胞, 低表達在正常細胞。改進(jìn)CAR-T細胞上scFv抗體的親和力。設計雙功能的CAR-T和自殺開(kāi)關(guān)如引入iCasp9基因等。
CAR-T治療也面臨著(zhù)臨床風(fēng)險；
1，細胞因子風(fēng)暴，也叫細胞因子釋放綜合征。產(chǎn)生的原因是T細胞在殺死其它細胞的時(shí)候會(huì )釋放很多細胞因子如IL-6、INF-? 等，它們的作用是激活更多的免疫細胞來(lái)一起對抗這些病原體，這種正反饋機制保證了對病原體的快速清除。同時(shí)在臨床上也引起了劇烈的炎癥反應。由于CAR-T殺癌細胞實(shí)在是太快太有效了，于是瞬間在局部產(chǎn)生超大量的細胞因子，引起驚人的免疫反應，稱(chēng)為細胞因子風(fēng)暴。其臨床表現；病人超高燒不退，嚴重時(shí)可危及生命。前述CAR-T治療的最后一步是嚴密監護病人。女孩Emily Whitehead接受CAR-T治療的最后，曾經(jīng)高燒到昏迷不醒，病情危險。幸好后來(lái)使用抗IL-6R抗體Tocilizumab, 使她馬上轉危為安。當然現在臨床上經(jīng)驗已經(jīng)豐富了很多，對細胞因子風(fēng)暴有了認識并提前準備，控制風(fēng)險也更有把握了。
2，CAR-T治療另一毒性是神經(jīng)毒性。接受治療的病人會(huì )出現腦水腫，并可能因此致死。
CAR-T療法在白血病治療的成功激發(fā)了投資者的興趣，大量資金涌入CAR-T 領(lǐng)域，推動(dòng)了生物產(chǎn)業(yè)與研究機構的臨床研究合作。2014年6月，只有19名員工的KITE生物技術(shù)公司在納斯達克上市，一天內攬金1億3千萬(wàn)美！同樣不到20人的JUNO生物技術(shù)公司2014一年之內成功融資超過(guò)3億，并于當年12月在納斯達克上市時(shí)再次募集了2.65億美元。這兩個(gè)小公司沒(méi)有任何收入，沒(méi)有一個(gè)上市的藥物，是因為投資人青睞CAR-T的技術(shù)，一個(gè)也許能治愈癌癥的技術(shù)。
賓夕法尼亞大學(xué)攜手諾華(Novartis)；KITE則與NCI合作。2013年，Fred Hutchinson癌癥中心、Memorial Sloan Kettering 癌癥中心和西雅圖兒童醫院的科學(xué)家聯(lián)手成立了JUNO。形成了三巨頭鼎立的局面。另外，禮來(lái)、葛蘭素史克、強生、默克也投資介入CAR-T領(lǐng)域。其他的CAR-T研發(fā)型企業(yè)包括BlueBird、Bellicum、Cellectis等多家也涉足CAR-T療法。2015年CAR-T研發(fā)型企業(yè)17家，2016年超過(guò)100多家。
2012年，Novartis與賓夕法尼亞大學(xué)合作開(kāi)發(fā)基于CD19 靶點(diǎn)的CAR-T技術(shù)，斥資2000萬(wàn)美元新建實(shí)驗室，2014年又斥資2000萬(wàn)美元在賓大醫學(xué)院建立一個(gè)細胞療法研究中心，成為全球首個(gè)綜合性CAR-T細胞療法開(kāi)發(fā)中心。2014 年7 月，其CTL019 獲得了FDA的突破性療法認定，藥物研發(fā)完畢后享受一切FDA 審批的綠色通道。美國賓州大學(xué)教授Carl H. June 的臨床試驗和Emily 的治療都是源于Novartis的合作。
Juno Therapeutics (JUNO)則與上述的三家醫學(xué)機構合作。在2016 6月ASCO上報道的臨床研究中，51名復發(fā)或難治性（r / r）急性淋巴細胞白血?。ˋLL）成年患者用環(huán)磷酰胺或氟達拉濱/ 環(huán)磷酰胺，然后輸注JCAR015。隨訪(fǎng)研究觀(guān)察到90％的完全緩解率（CR）。然而在同年7月6日，JCAR015在Ⅱ期臨床試驗中導致2例患者腦水腫死亡而被叫停。JUNO認為是由于CAR-T治療前用藥氟達拉濱引起。但是去除氟達拉濱后繼續臨床試驗，11月23日又出現了三個(gè)腦水腫死亡病例，JUNO不得不終止JCAR015臨床試驗，痛失了在CAR-T的領(lǐng)先地位。JUNO將其重心轉向其它產(chǎn)品，JCAR17 和 JCAR14等。它們的區別見(jiàn)圖9。
圖9， JUNO JACR-14, JCAR-15 和 JCAR17。

KITE 與美國國家癌癥研究所（NCI）建立了廣泛的合作關(guān)系， 2016年 12月ASH上，KITE公布了其CAR-T療法KTE-C19-101（ZUMA-1）針對難治性惡性NHL的臨床數據。51例DLBCL患者中完全緩解率為47%。KITE 的研發(fā)進(jìn)度原本稍落后于JUNO和Novartis。但是在2016年12月4日，KITE 宣布其領(lǐng)先產(chǎn)品KTE-C19已經(jīng)啟動(dòng)BLA滾動(dòng)申報，適應癥為B細胞非霍奇金淋巴瘤，從而后來(lái)居上。KTE-C19的共刺激分子與JUNO的JCAR15一樣為CD28，而不是4-BB。見(jiàn)圖10。
圖10，

研究人員幾十年來(lái)一直在努力探索，利用身體免疫系統來(lái)對抗腫瘤。這些努力正在取得成效。癌癥免疫療法目前在CAR-T和免疫檢查點(diǎn)抑制劑（另文詳述）兩種不同的技術(shù)上，臨床治療獲得顯著(zhù)成效?？茖W(xué)雜志的編輯們選擇了癌癥免疫治療作為2013年度的重大突破。
從目前CAR-T的臨床前實(shí)驗研究結果和臨床應用方面來(lái)看，治療血液癌癥，特別是CD19抗原的腫瘤效果很好，但在實(shí)體瘤的效果不佳，同時(shí)也遇到安全性和治療后復發(fā)等問(wèn)題。產(chǎn)業(yè)化制備也有待于降底治療的成本。既使這樣，CAR-T和免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療癌癥的免疫療法已初露曙光。
張克明；2017年3月31日