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自然殺傷(NK)細胞是一類(lèi)獨特的天然淋巴樣細胞，具有識別和清除病毒感染細胞和腫瘤細胞的固有能力。NK細胞具有多種細胞毒機制和通過(guò)細胞因子的產(chǎn)生調節免疫反應的能力，在抗癌免疫中發(fā)揮著(zhù)關(guān)鍵作用。近年來(lái)，隨著(zhù)嵌合抗原受體(CAR)工程的過(guò)繼T細胞療法的成功，以及將細胞轉化為強大的抗腫瘤武器的技術(shù)進(jìn)步，人們對NK細胞作為免疫治療候選細胞的興趣呈指數級增長(cháng)。在臨床上，第一代NK細胞療法取得了令人振奮的結果，顯示出了強大的療效和顯著(zhù)的安全性，從而推動(dòng)了繼續創(chuàng )新的巨大熱情。本文就增強NK細胞毒性和持久性的各種策略做一個(gè)簡(jiǎn)單介紹，以指導如何設計下一代NK細胞產(chǎn)品。

01
CAR/TCR工程化NK細胞

嵌合抗原受體(CARs)是一種人工合成的融合蛋白，由胞外抗原識別結構域和胞內信號部分組成，可觸發(fā)細胞激活。CAR工程T細胞療法是第一個(gè)出現的，并開(kāi)發(fā)了用于免疫腫瘤學(xué)應用的各種產(chǎn)品。自那以后，該領(lǐng)域迅速擴大，NK細胞也被整合到基因工程管道中。研究表明， CAR工程化NK細胞可以有效和特異性地靶向腫瘤，同時(shí)保持理想的安全性 (圖1) 。

圖1. CAR NK細胞示意圖

基于CAR的細胞治療的一個(gè)關(guān)鍵障礙是抗原逃逸，這是腫瘤通過(guò)抗原丟失或下調來(lái)逃避免疫反應的過(guò)程。已經(jīng)采取了各種戰略來(lái)解決這一問(wèn)題。靶向多種抗原是一種可行的方法，既可以提高腫瘤檢測的嚴格性，又可以擴大治療效益(圖2)。這通常是通過(guò)表達兩個(gè)單獨的CAR(每個(gè)CAR針對腫瘤上的不同抗原并連接到兩個(gè)單獨的信號內域)的雙順?lè )醋訕嫿w來(lái)實(shí)現的，或者通過(guò)表達包含雙特定識別結構域的單個(gè)CAR來(lái)實(shí)現的，每個(gè)CAR串聯(lián)靶向不同的抗原并連接到單個(gè)信號內域。

圖2.多抗原靶向CAR NK策略

還探索了改進(jìn)CAR介導的激活控制的策略，特別是將靶上、腫瘤外效應所產(chǎn)生的毒性降至最低。已經(jīng)通過(guò)使用logic-gated CAR策略來(lái)促進(jìn)選擇性靶向，被證明可以解決其中的一些問(wèn)題。在這項工作中，研究小組通過(guò)二價(jià)CAR靶向AML細胞上的FLT3/CD33，并使用抑制性CAR將抗原結合到健康的造血干細胞(HSCs)上，并誘導出‘NOT signal’以防止細胞殺傷（圖3）。

圖3. logic-gated CAR策略

基于CAR的方法的另一個(gè)關(guān)鍵限制是，在大多數情況下，檢測能力僅限于表面蛋白質(zhì)。細胞內抗原以多肽-人類(lèi)白細胞抗原復合體的形式存在，通過(guò)TCR可以檢測到。改造NK細胞表達TCR可以檢測到這樣的多肽(圖4)。TCR引導的NK-92細胞最近被證明介導了成功的抗腫瘤反應。雖然需要更多的研究來(lái)驗證這種方法的臨床適用性，但一個(gè)潛在的優(yōu)勢是，因為NK細胞不具有內源性TCR，因而不會(huì )出現錯配的問(wèn)題。然而，缺點(diǎn)是NK細胞沒(méi)有配備T細胞中的完整信號機制，從而潛在地損害了通過(guò)合成TCR有效激活的能力。

圖4. TCR NK細胞示意圖

02
NK細胞銜接器

NK細胞也可以通過(guò)銜接器被引導到腫瘤部位，通過(guò)觸發(fā)NK細胞上的激活受體，同時(shí)將靶抗原結合到腫瘤細胞上，從而引發(fā)強大的NK細胞介導的抗腫瘤反應(圖5)。其他NK細胞銜接器策略包括三特異性和四特異性抗體設計，旨在通過(guò)靶向腫瘤上的多個(gè)抗原或通過(guò)交叉連接細胞因子部分來(lái)支持NK增殖和存活來(lái)增強抗腫瘤效果。NK 細胞銜接器的使用繞過(guò)了工程化，不需要載體介導的基因轉移，因此代表了一種更簡(jiǎn)單、成本更低的制造工藝，但可以提供CAR-like活性。

圖5. NK 細胞銜接器示意圖

各種臨床前研究表明，當使用NK 細胞銜接器來(lái)靶向血液瘤和實(shí)體腫瘤時(shí)，展現了強大的抗腫瘤功效。例如，最近的研究表明，當通過(guò)使用靶向AML上的CLEC12A靶向腫瘤以及人源化的抗CD16單域抗體和IL-15激活NK細胞的三特異性NK 細胞銜接器，NK細胞對原發(fā)AML患者來(lái)源的AML體內腫瘤模型具有強大抗腫瘤效應（圖6）。

圖6. CLEC12ATriKE體內抗腫瘤效果

一些臨床試驗實(shí)驗的開(kāi)展，需要評估這些NK細胞銜接器的抗腫瘤效果的持久性，并確定是否需要多種治療才能獲得持續的治療效果。

03
細胞因子武裝

雖然CAR和TCR工程技術(shù)尋求通過(guò)基因重定向其特異性來(lái)增強NK細胞的功能，但也有一些舉措旨在有效地在體外和體內激活NK細胞，以維持最佳的抗腫瘤功能和持久性。眾所周知，新分離的NK細胞與已被激活的NK細胞相比，其殺細胞能力較低。解決這一限制的一種方法是細胞因子介導的激活。用IL-2、IL-15和IL-21組合的細胞因子體外擴增NK細胞增強了細胞毒功能、高增殖率，同時(shí)保持細胞處于健康、未耗竭的狀態(tài)。

現在已經(jīng)很清楚，當在IL-12/15/18存在的情況下培養時(shí)，PB-NK細胞可以轉變?yōu)橐环N被稱(chēng)為細胞因子誘導的記憶樣NK細胞的表型。在移植前和移植后的環(huán)境中，細胞因子誘導的記憶樣NK細胞在R/R復發(fā)性髓系腫瘤患者中都顯示出臨床療效。設計記憶樣NK細胞來(lái)表達CAR可以增強抗腫瘤反應，從而增強對抗NK耐藥腫瘤的效力。

盡管這些數據有力地表明了細胞因子激發(fā)的優(yōu)勢，但持續的體外刺激會(huì )使NK細胞“細胞因子成癮”，并導致在缺乏體內細胞因子支持的情況下輸注這些細胞時(shí)其持久性降低。為了避免這個(gè)問(wèn)題，同時(shí)仍然利用細胞因子激活的好處，通過(guò)基因工程，NK細胞被修飾以產(chǎn)生支持細胞潛能、增殖和持久性的細胞因子(圖7)。這種自分泌細胞因子極大的引起了研究人員的興趣，CAR工程化的NK細胞為了提高其持久性也采用了攜帶補充細胞因子信號的基因工程化策略。由工程NK細胞產(chǎn)生的細胞因子還可以介導旁觀(guān)者效應，從而激活存在于腫瘤微環(huán)境中的其他免疫效應細胞，如T細胞或髓系細胞，從而潛在地進(jìn)一步增強抗腫瘤反應。

圖7. NK細胞細胞因子基因工程修飾

04
克服免疫抑制

TME由復雜和嚴酷的代謝環(huán)境組成，其特征是免疫抑制代謝物、葡萄糖和氨基酸缺乏、低氧和酸性的異質(zhì)混合。這些因素協(xié)同作用阻止了有效的抗腫瘤免疫。特別是在實(shí)體腫瘤中，缺氧是免疫細胞功能障礙的常見(jiàn)驅動(dòng)因素。已有研究表明，缺氧性TME中NK細胞功能受損，部分原因是MDSCs、Treg和M2巨噬細胞在TME中的含量增加，以及缺氧對NK細胞功能的直接影響。據報道，抑制NK細胞中缺氧反應的HIF1a信號可以增強NK細胞的效力，并釋放NK細胞介導的抗腫瘤功能。

腫瘤往往表現出異常的代謝行為，導致乳酸水平升高、重要營(yíng)養物質(zhì)枯竭以及有毒分解代謝物、腺苷和活性氧類(lèi)濃度增加。為了克服代謝免疫抑制的有害影響，目前的策略主要集中在兩個(gè)領(lǐng)域：改變腫瘤的代謝構成或修改免疫細胞中的基因表達程序，以保護它們免受TME中抑制代謝物的影響。當然我們試圖調節TME中的免疫代謝時(shí)，實(shí)現生理平衡是很重要的，因為一些代謝物是正常代謝的重要組成部分。目前許多策略仍在開(kāi)發(fā)中，通過(guò)TME調節和NK細胞工程相結合的方法可能會(huì )進(jìn)一步減少免疫抑制。

05
免疫檢查點(diǎn)調節

腫瘤已經(jīng)進(jìn)化出復雜的機制來(lái)逃避免疫監視，包括參與免疫檢查點(diǎn)，這可能會(huì )以與T細胞類(lèi)似的方式抑制NK細胞。

抑制性KIR是NK細胞功能的強有力的負性調節因子，當與HLA class I類(lèi)配體結合時(shí)，可以覆蓋任何伴隨的激活信號。由于其在抑制NK細胞功能中的重要作用，抑制性KIR引起了研究者與制藥公司的極大興趣。Lirilumab是一種panKIR2D抗體，通過(guò)阻斷這些抑制性KIRs，使NK細胞激活。然而，在兩個(gè)早期臨床試驗中，Lirilumab未能引起有臨床意義的應答。這些結果的一個(gè)潛在原因可能源于抑制性KIR在NK細胞教育和licensing的重要作用。在這一假設下，Lirilumab持續阻斷KIRs可能會(huì )對NK細胞功能產(chǎn)生負面影響。

與KIR分子類(lèi)似， NKG2A是另一種重要的負性NK細胞調節因子，當與其同源配體HLAE結合時(shí)，可抑制NK細胞的細胞毒作用。Monalizumab破壞了這種相互作用，當與西妥昔單抗聯(lián)合使用時(shí)，在以前治療過(guò)的復發(fā)或轉移性頭頸部鱗狀細胞癌患者中產(chǎn)生了的31%的客觀(guān)應答率。Monalizumab目前正在接受針對其他實(shí)體腫瘤的測試，包括結直腸癌和非小細胞肺癌等。

這些方法的共同之處是依賴(lài)單抗來(lái)調節患者的免疫細胞，然而由于它們在體內的半衰期有限，這一策略需要多次輸注。隨著(zhù)基因編輯能力的進(jìn)步，NK細胞可以穩定地被修飾，以調節增強NK細胞效應器功能。一個(gè)例子是抑制受體NKG2A的被遺傳破壞，這導致了接種了HLAE+腫瘤的異種移植小鼠模型中的腫瘤控制良好。

06
加強NK細胞對腫瘤的轉運

NK細胞運輸和穿透腫瘤床的能力是有效抗腫瘤免疫的關(guān)鍵先決條件。與其他免疫細胞類(lèi)似，NK細胞通過(guò)TME分泌的趨化因子受體及其同源配體的動(dòng)態(tài)相互作用而被引導至腫瘤部位。近年來(lái)，越來(lái)越多的工作研究了如何利用這些相互作用的調節來(lái)增強對腫瘤的有效歸巢。

早期的研究集中在擴增誘導的趨化因子受體以及瞬時(shí)轉染法，但由于內化和降解導致趨化因子表達的迅速喪失。這使得研究者通過(guò)采用基因工程策略來(lái)穩定地為NK細胞配備異位趨化因子受體，如CXCR2、CXCR4等。目前的臨床前數據支持趨化因子受體調節可以促進(jìn)NK細胞在多種難以治療的腫瘤中的轉移，包括多發(fā)性骨髓瘤，膠質(zhì)母細胞瘤，腎細胞癌，胰腺導管腺癌和卵巢癌等。

小結

隨著(zhù)創(chuàng )新藥物策略的加速發(fā)展和下一代技術(shù)的出現，各種NK細胞產(chǎn)品被設計用于癌癥治療。隨著(zhù)該領(lǐng)域的進(jìn)展，闡明決定NK細胞效力和持久性的關(guān)鍵參數將是重要的，這將有利于我們優(yōu)化和設計下一代基于NK的治療藥物。

參考文獻

1.Natural killer cells in antitumour adoptive cell immunotherapy.

2.A trispecific killer engager molecule against CLEC12A effectively induces NK-cell mediated killing of AML cells.

3.Pluripotent stem cell-derived NK cells with high-affinity noncleavable CD16a mediate improved antitumor activity.